Первичная структура белка. Первичная структура белков

Строение белка может быть представлено одним из четырех вариантов. Каждый вариант обладает собственными особенностями. Так, существует четвертичная, троичная, вторичная и первичная

Последний в этом списке уровень представляет собой линейную полипептидную цепь из аминокислот. Аминокислоты соединяются друг с другом пептидными связями. Первичная является простейшим уровнем организации молекулы. Посредством ковалентных пептидных связей между альфа-аминогруппой в одной аминокислоте и альфа-карбоксильной группой в другой обеспечивается высокая стабильность молекулы.

При формировании в клетках пептидных связей активируется сначала карбоксильная группа. После происходит соединение с аминогруппой. Приблизительно так же осуществляется полипептидный лабораторный синтез.

Пептидная связь, представляющая собой повторяющийся фрагмент полипептидной цепи, обладает рядом особенностей. Под воздействием этих особенностей не только формируется первичная структура белка. Они влияют и на высшие организационные уровни полипептидной цепи. Среди основных отличительных черт выделяют копланарность (способность всех атомов, которые входят в пептидную группу, находиться в одной плоскости), трансположение заместителей относительно С-N-связи, свойство существовать в 2-х резонансных формах. К особенностям пептидной связи относят также способность к формированию водородных связей. При этом от каждой пептидной группы может образовываться по две водородные связи с прочими группами (пептидными в том числе). Однако существуют исключения. К ним относят пептидные группы с аминогруппами гидроксипролина или пролина. Они могут формировать только лишь одну Это оказывает воздействие на образование вторичной белковой структуры. Так, на участке, где располагается гидроксипролин или пролин, пептидная цепь легко изгибается, в связи с тем, что нет второй водородной связи, которая удерживала бы ее (как обычно).

Название пептидов формируется из названий аминокислот, входящих в них. Дипептид дают две аминокислоты, трипептид - три, тетрапептид - четыре и так далее. В каждой полипептидной цепи (или пептиде) любой длины присутствует N-концевая аминокислота, в которой содержится свободная аминогруппа, и С-концевая аминокислота, в которой присутствует свободная карбоксильная группа.

Свойства белков.

При изучении этих соединений ученых интересовало несколько вопросов. Исследователи, прежде всего, стремились выяснить размеры, определить форму и массу молекул белков. Следует отметить, что это были достаточно сложные задачи. Трудность состояла в том, что определение по увеличению растворов белков (как это осуществляется у прочих веществ) невозможно, ввиду того, что белковые растворы кипятить нельзя. А определение показателя в соответствии с понижением температуры замерзания результаты дает неточные. Кроме того, белки в чистом виде никогда не встречаются. Однако при помощи разработанных методов было установлено, что колеблется в пределах от 14 до 45 тысяч и больше.

Одной из важных характеристик соединений является фракционное высаливание. Этот процесс представляет собой выделение белков из растворов после прибавления соляных растворов с различными концентрациями.

Еще одним немаловажной характеристикой является денатурация. Этот процесс происходит при осаждении белков тяжелыми металлами. Денатурация представляет собой потерю натуральных свойств. Этот процесс предполагает разные превращения молекулы, кроме разрыва полипептидной цепи. Другими словами, первичная структура белка при денатурации остается неизменной.

Белки (протеины) - это высокомолекулярные полимерные соединения пептидной природы (полигетероаминокислоты).

Первичная структура белков - это последовательность чередования аминокислотных остатков в полипептидной цепи (ППЦ) .

Первичная структура белков является ковалентной структурой, поскольку в её основе лежит пептидная связь между a-амино- и a-карбоксильными группами аминокислот. Вследствие этого полипептидные цепи имеют неразветвленный характер.

Скелет (хребет, остов) полипептидной цепи состоит из регулярно повторяющихся структурных элементов

Полипептидная цепь обладает векторностью, направление цепи от N-конца (начало цепи) к C-концу (конец цепи), N-конец - это конец, на котором находится свободная a-аминогруппа. C-конец - это конец, на котором находится свободная a-карбоксильная группа. Аминокислотная последовательность белков обозначается, начиная с N-конца, с использованием трехбуквенных сокращенных названий аминокислот, например: гли-ала-цис-про. Может быть использовано и однобуквенное обозначение аминокислотных остатков в белке.

N- и C-концы в составе белков могут быть модифицированы. Аминогруппа на N-конце может быть ацетилирована, формилирована или метилирована. В ряде белков N-концевым является остаток пирролидонкарбоната (пироглутамата), не содержащий свободной аминогруппы. C-конец может быть амидирован. Модификации C-конца более редки по сравнению с N-концевыми модификациями.

Коэффициент поликонденсации белков варьирует в диапазоне от 50 до 2500. Обычно белок содержит 100-300 аминокислотных остатков. Поскольку средняя молекулярная масса одного аминокислотного остатка составляет около 110 Да, молекулярная масса белков варьирует в диапазоне от 6000 до миллионов Да.

Каждый индивидуальный белок обладает уникальной первичной структурой. Первым белком, чья первичная структура была установлена, явился инсулин. Это удалось сделать Сэнгеру. Его стратегия заключалась в следующем. Сначала он разделил две полипептидные цепи и далее провел их специфическое ферментативное расщепление на небольшие пептиды, содержащие перекрывающиеся последовательности. Затем, используя 1-фтор-2,4-динитробензол идентифицировал N-концевые остатки. Кроме того, он определил аминокислотный состав пептидов и в итоге смог установить их структуру, сравнивая последовательности перекрывающихся пептидов. В общих чертах стратегия Сэнгера сохранила свое значение до наших дней. Однако были предложены и иные подходы. Эдманом разработан метод автоматической процедуры последовательного отщепления и идентификации N-концевых аминокислотных остатков. Для расшифровки первичной структуры можно использовать рентгеноструктурный анализ. Последовательность аминокислотных остатков может быть определена по нуклеотидной последовательности матричной РНК.

В настоящее время установлена первичная структура более 2000 белков. Теоретически число различных вариантов первичной структуры белков безгранично. Даже для полипептида из 20 различных аминокислот, число возможных последовательностей составляет 20´10 18 . В живой природе реализуется лишь незначительная доля возможных последовательностей, общее число которых у всех видов живых организмов оценивается величиной 10 10 -10 12. .

Первичная структура белков генетически детерминирована, т.е. последовательность аминокислот в белке определяется последовательностью нуклеотидов в ДНК . Искажения последовательности нуклеотидов ДНК приводят к возникновению аномальных белков с измененными биологическими свойствами, что является причиной молекулярной патологии. В частности, причиной серповидноклеточной анемии служит точечная мутация гена, контролирующего b-цепь гемоглобина. Следствием этого является замена в 6-ом положении b-цепи остатка глутамата на валин. Такая замена приводит к утрате одного отрицательного заряда в каждой из двух b-цепей, что приводит к изменению конформации гемоглобина и утрате его биологической функции.

Гомологичными белками называются белки, выполняющие у разных видов одинаковые функции. Примером может служить гемоглобин: у всех позвоночных он выполняет одну и ту же функцию, связанную с транспортом кислорода. Гомологичные белки характеризуются наличием во многих положениях одних и тех же аминокислот. Как оказалось, число аминокислотных остатков, по которым различаются гомологичные белки пропорционально филогенетическому различию между данными видами. Например, молекулы цитохромов С лошади и дрожжей различаются по 48 аминокислотным остаткам, тогда как те же молекулы курицы и утки – только по 2 остаткам. Что касается цитохромов С курицы и индейки, то они имеют идентичные аминокислотные последовательности. Сведения о числе различий в аминокислотных последовательностях гомологичных белков из разных видов используют для построения эволюционных карт, отражающих последовательные этапы возникновения и развития различных видов животных и растений в процессе эволюции.

Первый этап в определении первичной структуры белков заключается в качественной и количественной оценке аминокислотного состава данного индивидуального белка.

Кислотный гидролиз белка

Для определения аминокислотного состава необходимо провести разрушение всех пептидных связей в белке. Анализируемый белок гидролизуют в 6 мол/л НС1 при температуре около 110 °С в течение 24 ч. В результате разрушаются пептидные связи в белке, а в гидролизате присутствуют только свободные аминокислоты

Разделение аминокислот с помощью ионообменной хроматографии Смесь аминокислот, полученных кислотным гидролизом белков, разделяют в колонке с катионообменной смолой.

Количественный анализ полученных фракций. нагреваютотдельные фракции аминокислот с нингидрином, образующим соединение красно-фиолетового цвета. Интенсивность окраски в пробе пропорциональна количеству находящейся в ней аминокислоты.

2. Определение аминокислотной последовательности в белке

Определение N-концевой аминокислоты в белке и последовательности аминокислот в олигопептидах

Изучение первичной структуры белков имеет важное общебиологическое и медицинское значение. Изучая порядок чередования аминокислотных остатков в индивидуальных, можно выявить общие фундаментальные закономерности формирования пространственной структуры белков.многие генетические болезни - результат нарушения в аминокислотной последовательности белков. Информация о первичной структуре нормального и мутантного белка может быть полезна для диагностики и прогнозирования развития заболевания.

Установление первичной структуры белков включает 2 основных этапа:

определение аминокислотного состава изучаемого белка;

аминокислотной последовательности в белке.

Например, при серповидноклеточной анемии в шестом положении β-цепи гемоглобина происходит замена глутаминовой кислоты на валин . Это приводит к синтезу гемоглобина S (HbS ) – такого гемоглобина, который в дезоксиформеполимеризуется и образует кристаллы. В результате эритроциты деформируются, приобретают форму серпа, теряют эластичность и при прохождении через капилляры разрушаются. Это в итоге приводит к снижению оксигенации тканей и их некрозу.

Последовательность и соотношение аминокислот в первичной структуре определяет формирование вторичной , третичной и четвертичной структур.

8 . Вторичная структура белка –пространственная структура, образующаяся в результате взаимодействий между функциональными группами, входящими в состав пептидного остова.регулярные структуры двух типов: а-спираль и б-структура.

Вторичная структура образуется только при участии водородных связей между пептидными группами: атом кислорода одной группы реагирует с атомом водорода второй, одновременно кислород второй пептидной группы связывается с водородом третьей и т.д.

α-Спираль

пептидный остов закручивается в виде спирали за счёт образования водородных связей между атомами кислорода карбонильных групп и атомами азота аминогрупп. Водородные связи ориентированы вдоль оси спирали. На один виток а-спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка.

В образовании водородных связей участвуют практически все атомы кислорода и водорода пептидных групп. В результате?-спираль "стягивается" множеством водородных связей. связи относят к слабых, их количество обеспечивает максимально возможную стабильность?-спирали. гидрофильность?-спиралей уменьшается, а их гидрофобность увеличивается.

Спиральная структура - наиболее устойчивая конформация пептидного остова, отвечающая минимуму свободной энергии. В результате образования?-спиралей полипептидная цепь укорачивается.

Радикалы аминокислот находятся на наружной стороне?-спирали и направлены от пептидного остова в сторонынекоторые из них могут нарушать формирование?-спирали. К ним относят:

пролин. Его атом азота входит в состав жёсткого кольца, что исключает возможность вращения вокруг -N-CH- связи. Кроме того, у атома азота пролита, образующего пептидную связь с другой аминокислотой, нет атома водорода. В результате пролин не способен образовать водородную связь в данном месте пептидного остова, и?-спиральная структура нарушается. Обычно в этом месте пептидной цепи возникает петля или изгиб;

участки, где последовательно расположены несколько одинаково заряженных радикалов, между которыми возникают электростатические силы отталкивания;

участки с близко расположенными объёмными радикалами, механически нарушающими формирование?-спирали, например метионин, триптофан

β-Складчатый слой Структура формируется за счёт образования множества водородных связей между атомами пептидных групп линейных областей одной полипептидной цепи, делающей изгибы, или между разными полипептидными цепями, ?-Структура образует фигуру, подобную листу, сложенному "гармошкой" Когда водородные связи образуются между атомами пептидного остова различных полипептидных цепей, их называют межцепочечными связями. Водородные связи, возникающие между линейными участками внутри одной полипептидной цепи, называют внутрицепочечными. В?-структурах водородные связи расположены перпендикулярно полипептидной цепи.

Если связанные полипептидные цепи направлены противоположно, возникает антипараллельная?-структура, если же N- и С-концы полипептидных цепей совпадают, образуется структура параллельного?-складчатог

9. Третичная структура – это укладка полипептидной цепи в глобулу ("клубок"). Четкой границы между вторичной и третичной структурами провести нельзя, в основе третичной структуры лежат стерические взаимосвязи между аминокислотами, отстоящими далеко друг от друга в цепи. Благодаря третичной структуре происходит еще более компактное формирование цепи. В стабилизации третичной структуры белка принимают участие:

ковалентные связи(между двумя остаткамицистеина-дисульфидные мостики);

ионные связимежду противоположно заряженными боковыми группами аминокислотных остатков;

водородные связи;

гидрофильно-гидрофобныевзаимодействия. При взаимодействии с окружающими молекулами воды белковая молекула «стремится» свернуться так, чтобы неполярные боковые группы аминокислот оказались изолированы от водного раствора; на поверхности молекулы оказываются полярныегидрофильныебоковые группы.

Связь с первичной структурой. Третичная структура в значительной степени предопределенапервичной структурой. Усилия по предсказанию третичной структуры белка основываясь на первичной структуре известна как задачапредсказания структуры белка. Однако, окружающая среда, в которой белок сворачивается существенно определяет конечную форму, но обычно непосредственно не принимается во внимание текущими методами предсказания. Большинство таких методов полагаются на сравнения с уже известными структурами, и таким образом включают окружающую среду косвенно.Супервторичная структура белков. сравнение конформаций разных по структуре и функциям белков выявило наличие у них похожих сочетаний элементов вторичной структуры. Такой специфический порядок формирования вторичных структур называют супервторичной структурой белков.она формируется за счёт межрадикальных взаимодействий. Определённые характерные сочетания а-спиралей и б-структур часто обозначают как "структурные мотивы".